GİRİŞ

Anopheles soyunda yer alan Maculipennis kompleks sibling ve kriptik türleri içerdiği anlaşılan sivrisinekler içerisinde ilk örnek olması ve medikal önemleri ile taksonomik klasifikasyon ve filogenetik ilişkiler üzerine çalışmalarda ilgi odağı olmuştur. Maculipennis kompleksin günümüze kadar palearktik bölgede 10’un üzerinde türü identifiye edilmiş olmakla birlikte (1) henüz ilgili coğrafik alanda genetik çeşitlilik üzerine veriler oldukça sınırlıdır. Ülkemizde günümüze kadar morfolojik analizlerle Anopheles soyunda 10 türün varlığı bildirilmiş olup bunlardan dördünün Maculipennis komplekste yer alan An. sacharovi, An. maculipennis s.s., An. melanoon ve An. messae olduğu görülmektedir (2-5). Anopheles sacharovi, An. atroparvus ve An. labranchiae ile birlikte palearktik bölgede geçmişten günümüze en etkin sıtma vektörleri olarak nitelenmektedir (6-9). Türkiye (3,7), Suriye (10,11) ve Orta Doğu’nun farklı bölgelerinde (12,13) P. vivax malaryasının en etkin vektörü An. sacharovi olarak kaydedilmiştir. Ayrıca Güney Avrupa Bölgeleri’nde ana potansiyel vektör olarak da görülmektedir (8,14). Anopheles türlerinin vektörlüğünü yaptığı sıtmanın önlenmesindeki en kritik nokta geleneksel olarak kullanılan insektisitlerle beraber sivrisinek popülasyonlarının baskılanmasıdır (15). Ancak bu mücadelede karşılaşılan en büyük sıkıntı insektisitlere karşı gelişen direnç mekanizmasıdır (16). Bu noktada sivrisineklere karşı kolesterol alımı veya taşınması gibi yeni biyoteknolojik yaklaşımlara ihtiyaç bulunmaktadır (17). İnsektler, tüm ökaryotlar gibi yapısal ve metabolik amaçlar için sterollere ihtiyaç duyarlar. Ancak insektler, tüm artropodlar gibi kolesterol sentez aşamasında anahtar enzimlerden yoksun oldukları için sterol üretemezler ve bu ihtiyaçlarını dışardan karşılamak zorundadırlar (18).

İnsektler kolesterole bağımlıdırlar, çünkü kolesterol olmadan gelişimlerini tamamlayamaz ve çoğalamazlar. Dolayısıyla dışarıdan kolesterol almak insektler için fizyolojik olarak bir zorunluluktur. Kolesterol oldukça hidrofobiktir. Taşıyıcı proteinler, kolesterolün hidrofobik kısmını sitoplazmanın veya hemolenfin sulu ortamından koruyarak kolesterolün verilmesine aracılık eder (19). Böceklerde kolesterolü hücre içi olarak orta bağırsak epitelinin lümenal tarafından bazal tarafına veya lipid damlacıklarından yağ gövdesindeki sitoplazmik membrana taşımak için bir sterol taşıyıcı proteine (SCP) ihtiyaç vardır. Aedes türleri üzerinde yapılan çalışmalarda (20-22), hücre içi bir sterol taşıyıcı protein olan SCP-2’nin hücresel kolesterol transferinden sorumlu olduğu gösterilmiştir.

Bu çalışmada, biyoteknolojik mücadele kapsamında çeşitli zararlı ve/veya hastalık nakleden böcekler için aşı adayı veya hedef ilaç bölgelerinden birisi olarak nitelenen SCP-2 geninin Anopheles sacharovi’de moleküler karakterizasyonunun ilk kez gerçekleştirilmesi ve bu antijenin sineğin yaşam dönemlerindeki ekspresyon analizlerinin karşılaştırmalı bir şekilde ortaya konulması amaçlanmıştır.

YÖNTEMLER

Anopheles Soyundaki Ergin Sivrisinek Örneklerinin Sahadan Toplanması

Anopheles soyundaki ergin sivrisinek örnekleri Mayıs-Ağustos 2021 tarihleri arasında Sultan Sazlığı ekosisteminden toplanmıştır. Belirlenen örnekleme alanlarında kan emmiş, yarı gravid veya gravid ergin An. sacharovi dişi örnekleri hayvan ahırları/barınakları, ev içleri, kiler, depo gibi uygun kapalı alanlarda gündüz saatlerinde bataryalı aspiratörler (2809D, BioQuip, ABD) ve hepa filtreli basit ağız aspiratörleri ve el fenerleri yardımıyla toplanmıştır (23). Örnekler küçük sivrisinek kafeslerine aktarılmış ve içerisinde buz aküleri bulunan arazi tipi taşınabilir buzluklara aktarılarak laboratuvara taşınmıştır. Örneklerin taşınma sırasında ölüm oranını azaltmak için buzluklar içerisine ayrıca nemli bez parçaları konulmuş, nemli ve serin bir ortamda taşınmaları sağlanmıştır.

Anopheles sacharovi’nin Morfolojik ve Moleküler İdentifikasyonu, İnsektaryumda Gelişim Dönemlerinin Elde Edilmesi

Morfolojik teşhis

İnsektaryuma getirilerek uygun kaplar içerisinde yumurtlamaları sağlanan tüm dişiler ayrılmış ve stereo-mikroskop altında ergin ve yumurta morfolojisine göre teşhis anahtarı ile (24,25) tür teşhisleri gerçekleştirilmiştir. Anopheles sacharovi dişi örneklerinin diğer grup örneklerine göre kanat lekelerinin daha az belirgin olması, scutumun soluk kahverenginde olması, sucutumda soluk doğrusal bir şeritin bulunmaması ve kanat ucu saçaklarının tek düze siyah olması gibi morfolojik karakterleri ile An. maculipennis grubunun diğer türlerinden (An. maculipennis s.s., An. melanoon, An. messeae) mikroskop ile ayrılması ve teşhis edilmesi mümkündür. Yumurtaların desenlenme biçimleri ve yumurta yüzgeçlerinin bulunma yerleri ve biçimleri ülkemizdeki An. maculipennis grubu türlerin ayrımında doğru sonuçlar vermektedir. An. sacharovi’nin yumurta deseni özellikleri diğer An. maculipennis grubu türlerinkinden farklıdır ve belirgin bant profilleri veya desenleri yoktur. Yumurtlayan ergin dişi örnekler PBS içerisinde en az üç kez yıkanarak kod numarasıyla birlikte -80 ºC’lik derin dondurucuya total RNA izolasyonunda kullanılmak üzere alınmıştır. Derin dondurucuya alınmadan önce her örneğin bacakları ayrılarak içerisinde %96’lık etanol bulunan ayrı steril mikrosantrifüj tüplerine moleküler teşhis için DNA izolasyonu amacıyla alınmıştır. Morfolojik teşhis sonucu An. sacharovi olarak teşhis edilen örneklere ait yumurtalar ise gelişim dönemlerinin eldesi için insektaryumda yetiştirme prosesine alınmıştır.

Moleküler teşhis

Ergin dişi ve yumurta morfolojisine göre An. sacharovi olarak teşhisi sağlanan örnekler, tür teşhislerinin konfirmasyonu için moleküler analizlere alınmıştır. Etanol bulunan mikrosantrifüj tüplerine alınan bacaklardan genomik DNA izolasyonu, GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific) ile gerçekleştirilmiştir. Örneklere ait gDNA izolatları, An. sacharovi ITS-2 (26,27) gen bölgesininin 180 bp’lik fragmentini spesifik olarak amplifiye eden primerlerle polimeraz zincir reaksiyonunda (PCR) analiz edilmiştir. PCR analizleri sonrası, hedef büyüklükteki ITS-2 gen bölgesi amplikonları ayrıca PCR primerleri ile sekans analizine tabii tutulmuş ve tür teşhisleri elde edilen nükleotid dizilerinin GenBank veritabanındaki referans izolatlarla birlikte hizalama analizleri yapılarak konfirme edilmiştir.

İnsektaryumda Gelişim Dönemlerinin Elde Edilmesi

An. sacharovi olarak teşhis edilen toplam 50 dişi sivrisinek örneğine ait yumurtalar larva 1 dönemi çıkana kadar bulundukları kaplar içerisinde takip edilmiştir. Birinci dönem larvaların çıkışını takiben tüm larvalar geniş ağızlı pipetler yardımıyla dikkatli bir şekilde gelişim kaplarına aktarılmıştır. Larval besleme sürecinden önce 240 (3 tekrar oluşturmak üzere) adet L1 SCP-2 geninin karakterizasyonu ve ekspresyon analizlerinde kullanılmak üzere ayrılarak üç kez PBS’den geçirilmiş ve sonrasında -80 ºC’lik derin dondurucuya konulmuştur. An. sacharovi’nin insektaryumda yetiştirilmesi ve gelişim dönemlerinin sağlanmasında ilgili referans protokoller takip edilmiştir (28,29). Gelişim dönemleri için insektaryum ortamının gerekli optimum sıcaklık, nispi nem ve fotoperiyot koşulları; 26-30 °C, %70±10 nispi nem ve 12saat:12saat aydınlık:karanlık fotoperiyot şeklinde ayarlanmıştır. Larval gelişim süreci takip edilerek yaklaşık 10-14 günde (30) (Yumurta-L1: 2-3 gün; L1-L2: 2-3 gün; L2-L3: 2-3 gün; L3-L4: 3-4 gün; L4-Pupa: 3-4 gün; Pupa-Ergin: 2-3 gün) pupaya dönüşen örneklerden L1, L2, L3, L4 ve pupa dönemleri için ilgili zaman aralıklarında SCP-2 geninin karakterizasyonu ve ekspresyon analizleri amacıyla sırasıyla 240, 180, 120, 60 ve 15 (3 tekrar oluşturmak üzere) (31) örnek ayrılarak üç kez PBS’den geçirilmiş ve sonrasında -80 ºC’lik derin dondurucuya konulmuştur. Larval besleme kaplarında gelişen pupalar küçük ve geniş ağızlı pipetler aracılığıyla toplanarak erginleşme kaplarına alınmış ve bu kaplar büyük yetiştirme kafesine aktarılmıştır. Yaklaşık 2-3 gün içerisinde pupadan çıkan ergin sinekler, büyük kafes içerisinde pamuklara emdirilmiş %10’luk şeker çözeltisi ve ayrıca çeşitli bitki öz sularıyla yaklaşık 2 gün beslenmeleri yapılmıştır. Takiben ergin erkek ve dişilerden bireysel olarak ayrılan üçer örnek üç kez PBS’den geçirilmiş ve sonrasında SCP-2 geninin karakterizasyon ve ekspresyon analizleri amacıyla -80 ºC’lik derin dondurucuya konulmuştur.

SCP-2 Geninin Karakterizasyonu ve Ekspresyon Analizleri

Total RNA izolasyonu ve cDNA sentezi

SCP-2 geninin moleküler karakterizasyonu amacıyla 50 adet dişi An. sacharovi örneğinden 7’si kullanılmıştır. Ayrıca her gelişim dönemi için oluşturulmuş üç replikasyondan birisi moleküler karakterizasyon çalışmasına dahil edilmiş ve böylece toplam 14 izolata ait total RNA’lar sekans analizleri için kullanılmıştır. Ekspresyon analizleri için insektaryumda yetiştirilen tüm gelişim dönemlerine ait örnekler kullanılmıştır. Sahadan toplanan ergin dişilerden bireysel total RNA izolasyonu GeneJET RNA Purification Kit (Thermo Scientific) ile gerçekleştirilmiş, insektaryum hattından ise ilgili gelişim dönemlerine ait belirtilen sayıda örneği içeren havuzlar oluşturulmuş ve total RNA izolasyonuna alınmıştır. Total RNA izolatlarından cDNA elde etmek için iScript cDNA Sentez Kiti (Bio-Rad) protokolü uygulanmıştır. Ekstrakte edilen RNA’ların miktarı, NanoDrop spektrometresi kullanılarak analiz edilmiş ve reaksiyon başına 100 ng RNA ilave edilmiştir. cDNA sentezi, ticari kit protokolüne göre termal döngü 25 °C’de 5 dk, 46 °C’de 20 dk, 95 °C’de 1 dk ve 4 °C’de soğutma olacak şekilde gerçekleştirilmiştir. Termal döngü protokolünün tamamlanmasından sonra örneklere ait elde edilen cDNA’lar kullanılana kadar -20 °C’de muhafaza edilmiştir. SCP-2 geninin An. sacharovi dişi nesillerinin tükrük bezi, orta bağırsak ve yağ dokusu gibi organlarında ekspresyon düzeylerinin araştırılması amacıyla insektaryum hattından elde edilen toplam 30 ergin dişiye ait ilgili dokular steril olarak diseke edilmiş ve her doku 10’arlı olarak tüplere yerleştirilmiş ve üç replikasyonun oluşumu sağlanmıştır.

SCP-2 geninin amplifikasyonu ve sekanslanması

Elde edilen cDNA kalıplarında SCP-2 gen bölgesinin amplifiye edilmesi için diğer bazı Anopheles ve Culex türlerine ait ilgili gen sekansları üzerinde optimum özellikte primer dizaynı gerçekleştirilmiş ve sonrasında SCP-2 geninin 216 bp kısmını çoğaltan SCP76F (5’-GTGCAGCAGATSTACAAGTTC-3’) ve SCP-291R (5’-CTCAACCTGTCCCTCCACRT CSAG-3’) primerleri sentezletilmiştir. PCR reaksiyonları 25 µL final konsantrasyonda hazır kullanımlık Dream Taq Hot Start Green PCR Master Mix (2X) (12,5 µL) (Thermo Fisher Scientific), 0,4 µM her bir primer (1,3 µL) ve 10-20 ng kalıp cDNA (2 µL) olacak şekilde hazırlanmıştır. Örnekler C1000 Touch thermalcycler cihazına (BioRad) yerleştirilerek, termal profil 95 °C’de 2 dk; 35 siklus 95 °C’de 30 sn, 57 °C’de 30 sn ve 72 °C’de 1 dk; 72 °C’de 10 dk olarak ayarlanmış ve amplifikasyon gerçekleştirilmiştir. Elde edilen PCR ürünlerinin her birinden 5 µL alınıp 130 V’de 30 dk, jel elektroforeze tabii tutulmuştur. Sonuçlar Gene Snap from Syngene analiz programı (UVP INC Uplant, CA) ile görüntülenip analiz edilmiştir. PCR analizleri sonrası, SCP-2 gen bölgesi amplikonları uygun konsantrasyonda hazırlanarak PCR primerleri ile birlikte Macrogen Europe firmasında çift yönlü olarak sekanslatılmıştır.

Nükleotid ve amino asit sekanslarının karakterizasyonu

Çift yönlü DNA dizisi belirlenen izolatlara ait kromotogramlar dikkatlice analiz edildikten sonra Geneious 2022.1.1 yazılımı (https://www.geneious.com) ile forward ve reverse dizilimler DeNovo Assamble kullanılarak contig analizi yapılmış ve ilgili gen için final konsensus dizilimler ortaya çıkarılmıştır. Elde edilen sekansların blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi) analizleri yapıldıktan sonra GenBank’ta mevcut diğer sivrisinek ve yakın taksonlara ait SCP-2 sekanslarıyla Geneious yazılımı üzerinden çoklu hizalamaları yapılarak interspesifik ve intraspesifik nükleotid ve aminoasit farklılıkları ortaya çıkarılmıştır. Filogenetik ağaç oluşturulmasında maximum likelihood (ML) analizi uygulanmıştır. Sekans evrimi için en uygun değişim modeli jModelTest v.0.1.1’de (32) belirlenmiştir. En düşük AIC (Akaike Information, Criterion, correction) skoru gösteren GTR+I modeli filogenetik ağaç oluşturulmasında kullanılmıştır. ML analizi Geneious yazılımı üzerinden PhyML plugini kullanılarak yapılmıştır. ML analizleriyle oluşturulan ağacın güvenilirliği 1,000 tekrarlı Bootstrap testi ile gerçekleştirilmiştir.

İzolatlara ait amino asit dizilimleri; protein yapısı yönünden analiz edilmiştir. SCP-2 proteinin transmembran bölgelerindeki amino asit dizilimlerinin sinyal peptid analizleri ve dizilimlerdeki tahmini antijenik peptidlerin varlığı Geneious yazılımı üzerinden EMBOSS Protein Analysis 1.0 plugin yazılımı kullanılarak yapılmıştır. An. sacharovi SCP-2 proteininin transmembran sarmallarının yapısı aynı yazılım üzerinden Transmembrane Prediction Tool 0.9 ile araştırılmıştır. İzoelektrik nokta ve proteinin tahmini moleküler ağırlığı ExPASy programı ile hesaplanmıştır.

SCP-2 Geninin Ekspresyon Analizleri

İstatistiksel Analiz

SCP-2 geninin An. sacharovi’nin farklı gelişim evreleri ve dokularındaki ekspresyon analizleri kantitatif reverse transkripsiyon-gerçek zamanlı-PCR ile gerçekleştirilmiştir. SCP-2 geninin, An. sacharovi laboratuvar hatlarından elde edilen larva (1,2,3,4 instar larvalar), pupa ve ergin dönemleriyle ergin dişilerin tükürük bezi, orta bağırsak ve abdomen karkasları gibi dokularında transkripsiyonel düzeylerinin belirlenmesi için analizler gerçekleştirilmiştir. SCP-2 proteinini kodlayan hedef gen bölgesinin bütün olarak amplifikasyonu amacıyla sentezlenen cDNA’lar kalıp olarak kullanılarak karakterize edilen gen bölgesi sekanslarından sybergreen tabanlı qPCR için genetik yazılımlarla optimum spesifik primer dizaynı yapılmıştır. Dizayn edilen SCP-2 gen bölgesi için AsacSCP-2sybrF (5'-TTCCGCATCCAGCAGAAC-3') ve AsacSCP-2sybrR (5'-CGAACATGATCTCATCGTCCAT-3') primerleri qPCR analizleri için standardize edilmiştir. Gerçek zamanlı PCR analizleri CFX Connect™ Real-Time PCR Sisteminde (BioRad) sybergreen tabanlı olarak gerçekleştirilip her örnek üç tekrar çalışılmıştır. Floresans okumaları her siklustan sonra 62 °C’de alınarak, PCR ürünlerinin identikliğinin konfirmasyonu için melting curve analizleri gerçekleştirilmiştir. mRNA düzeyleri, Aktin (AdrtACTF2- 5'-TCTGACCGACTACCTGAT-3' ve AdrtACTR2 5'-CATCTCCTGCTCGAAGTC-3') ve Ribozomal S17 (S17F-5'-GGGTCGTGTACGTACCAAGACG-3' ve S17R2 5'-CATAGTTATCGCGACGCTCACG-3') referans genleri eş zamanlı kullanılarak komperatif ΔΔCt metodu ile normalize edilmiştir (33,34). Normalize edilmiş mRNA düzeyleri, jenerasyon bazında farklı gelişim evreleri ile ergin dişilerden izole edilen dokular arasında Student’s t-test ile istatistiksel olarak analiz edilmiştir.

BULGULAR

Anopheles sacharovi Saha Örnekleri ve Morfolojik İdentifikasyon

Sahadan toplanan 283 adet dişi Anopheles örneklerinden 50 sivrisinek yumurtlatma prosesine alınmıştır. Yumurtlayan Anopheles dişi nesiller stero-mikroskop altında incelenmiş ve An. maculipennis grubunun diğer türlerinden (An. maculipennis s.s., An. melanoon, An. messeae) kanat lekelerinin daha az belirgin olması, scutumun soluk kahverenginde olması, sucutumda soluk doğrusal bir şeritin bulunmaması ve kanat ucu saçaklarının tek düze siyah olması gibi morfolojik karakterleri ile An. sacharovi olarak teşhis edilmiştir (Şekil 1). Ayrıca her bir dişi için elde edilen yumurtalar morfolojik olarak incelenmiş ve yumurtaların desenlenme biçimleri ve yumurta yüzgeçlerinin bulunma yerleri ve biçimleri ile An. sacharovi teşhisi doğrulanmıştır. Yumurtaların bu özellikleri, elde edilen tüm yumurtaların An. sacharovi dişilerine ait olduğunu göstermiştir (Şekil 1).

Anopheles sacharovi Nesillerinde ITS-2 Gen Bölgesinin Amplifikasyonu, Sekans ve Filogenetik Analiz Sonuçları

Morfolojik identifikasyonla An. sacharovi olarak teşhis edilen ve yumurtaları insektaryumda gelişmeye alınan toplam 50 adet dişi örneğin ayrılan bacaklarından elde edilen genomik DNA izolatlarının An. sacharovi spesifik ITS-2 PCR analizleri sonucu agaroz jel üzerinde hedef büyüklükte (180 bp) amplikonlar belirlenmiştir (Şekil 2). Sekans analizi için tüm izolatlara ait amplikonların PCR primerleri ile çift yönlü olarak sekanslanması sonucu izolatlara ait forward ve reverse kromotogramlar Geneious 2020.1.1 yazılımında de novo assamble ile işlenerek kalite skoru yüksek konsensus dizilimler elde edilmiştir. Elde edilen tüm nükleotid sekansların birbirine %100 benzer olduğu görülmüştür. Yapılan blast analizi sonucunda izolatlara ait ITS-2 nükleotid sekansının GenBank veritabanında kayıtlı diğer An. sacharovi sekanslarıyla yüksek düzeyde benzer olduğu belirlenmiş ve böylece çalışmaya dahil edilen toplam 50 dişi An. sacharovi neslinin tür konfirmasyonları gerçekleştirilmiştir.

An. sacharovi Nesillerinde SCP-2 Geninin Moleküler Karakterizasyonu

SCP-2 geninin amplifikasyon sonuçları

Çalışma kapsamında morfolojik ve moleküler identifikasyonları sağlanan sahadan izole edilmiş ve yumurtaları yetiştirmeye alınmış toplam 7 ergin dişi ile insektaryumda gelişim dönemleri için oluşturulmuş replikasyonlardan seçilen toplam 7 izolata (L1-L4, Pupa, ergin dişi, ergin erkek) ait cDNA’ların SCP-2 gen bölgesi yönünden PCR sonuçları Şekil 3’te verilmiştir. PCR amplifikasyonu sonucunda agaroz jel üzerinde tüm izolatlar için hedef büyüklükte (216 bp) amplikonlar belirlenmiştir.

An. sacharovi Nesillerinde SCP-2 Geninin Nükleotid ve Amino Asit Sekans Karakterizasyonu Sonuçları

Nükleik asit sekans karakterizasyonu ve filogenetik analizi

Karakterizasyonu yapılan 14 izolata ait nükleotid sekanslarının hizalama analizlerinde 12’sinin %100 benzer olduğu, aynı nükleotid dizilimine sahip kalan 2 izolatın ise 183. bazda “T” yerine “C” değişimi gösterdiği belirlenmiştir. Elde edilen bu verilerle karakterize edilen An. sacharovi SCP-2 sekansları sırasıyla TR_Ansac1_SCP-2 (GenBank aksesyon: OL957181) ve TR_Ansac2_SCP-2 (GenBank aksesyon: OL957182) izolat adlarıyla GenBank veritabanına kayıt edilmiştir. TR_Ansac1_SCP-2 ve TR_Ansac2_SCP-2 sekansları arasında %0,5 genetik farklılık saptanmıştır. Çalışmada karakterize edilen An. sacharovi SCP-2 gen bölgesi sekansları ile GenBank veritabanında kayıtlı Anopheles, Aedes ve Culex soylarındaki diğer bazı türlere ait SCP-2 gen bölgesi sekansları kullanılarak oluşturulan filogenetik ağaçta izolatların tür ve soy bazlı olarak kümelenme gösterdiği ve monofiletik yapı sergilediği görülmüştür (Şekil 4). Çalışmamızda karakterize edilen An. sacharovi izolatlarının Anopheles kümesi içerisinde An. stephensi ve An. funestus’la birlikte alt küme oluşturduğu ve bu türlerin SCP-2 gen bölgesi sekanslarının birbirine daha yakın olduğu tespit edilmiştir. Anopheles soyu içersinde incelenen türlere ait SCP-2 sekanslarının ortalama genetik farklılığı %10,45 belirlenmiştir.

SCP-2 geninin kodladığı proteinin in-silico analiz sonuçları

Anopheles sacharovi SCP-2 geninin in-silico analizleri sonucu SCP-2 gen sekansları içerisinde belirlenen tek nükleotid değişiminin amino asit diziliminde farklılığa yol açmadığı görülmüştür. Anopheles sacharovi SCP-2 genin 216 bp gen diziliminin kodladığı 72 aa zincirinin ifade ettiği proteinin 7,915 kDa büyüklüğünde olduğu, transmembran bölge içermeyip tamamen sitoplazmik karakterde olduğu belirlenmiştir (Şekil 5). SCP-2 geninin aminoasit zinciri içerisinde 13 ve 18 aa uzunluğunda ve antijenik skorları da sırasıyla 1,089 ve 1,143 olan 2 antijenik bölge bulunduğu görülmüştür. İlgili proteinin izoelektronik noktasının 4,26 olduğu ve pH 7’de aktivasyon değerinin de -4,08 olduğu tespit edilmiştir.

Anopheles sacharovi’de SCP-2 Geninin Ekspresyon Analiz Sonuçları

SCP-2 geninin qPCR amplifikasyon sonuçları

An. sacharovi SCP-2 geninin ekspresyon analizleri için dizayn edilen qPCR primerli ile normalizasyon genleri Aktin ve ribozomal S17 için primerlerin hem gelişim dönemleri hem de dokulardan izole edilen total RNA izolatlarında etkin olarak çalıştığı ve spesifik melt pik gösterdikleri görülmüştür (Şekil 6).

Gelişim dönemlerinde SCP-2 geninin ekspresyon analizi

SCP-2 geninin An. sacharovi gelişim dönemlerindeki ekspresyon düzeyleri Şekil 7’de gösterilmiştir. qPCR’de ekspresyon analizleri sonucunda SCP-2’nin en yüksek ergin erkeklerde ifade olduğu bunu sırasıyla ergin dişi, L4, L3, L2, L1 ve pupa dönemlerinin izlediği belirlenmiştir. Tüm gelişim dönemleri arasındaki SCP-2 ekspresyon kat değişimi arasındaki farklılıklar istatistiksel olarak önemli (p<0,05) bulunmuştur.

Ergin dişi dokularında SCP-2 geninin ekspresyon analizi

SCP-2 geninin An. sacharovi ergin dişi tükrük bezi, orta bağırsak (midgut) ve yağ (fat body) dokularındaki ekspresyon düzeyleri Şekil 8’de gösterilmiştir. qPCR’de ekspresyon analizleri sonucunda SCP-2’nin en yüksek fatbody’de ifade olduğu bunu sırasıyla midgut ve tükrük bezinin izlediği belirlenmiştir. Ergin dişi dokuları arasındaki SCP-2 ekspresyon kat değişimi istatistiksel olarak önemli (p<0,05) bulunmuştur.

TARTIŞMA

SCP-2, her birinin sterol-bağlayıcı alan taşıdığı SCP-2, SCP-x, SCP-like-2, SCP-like-3, 17b-hydroxysteroid dehydrogenase tip IV, ve stomatin’i içeren SCP-2 gen ailesinin bir üyesidir (35). SCP-2 geninin insan kromozom bandı 1p32.3’de yerleştiği ve 18 exon ve 123 amino asitten oluştuğu belirlenmiştir (36). SCP-x veSCP-2’yi bir genin kodladığı ve SCP-x’in diğer bir transkripsiyon bölgesinden geldiği bilinmektedir. Her bir mRNA ortak bir C- terminus yapısı gösteren bir prekürsor 15 kDa pro-SCP-2 proteini ve tüm-uzunlukta 58 kDa SCP-x proteinine transkribe olur. 58-kDa SCP-x kısmi post-translasyonel modifakasyon geçirir ve takiben tam fonksiyonel 13 kDa SCP-2 ve 46-kDa proteine ayrılır (37). Açıkca, 15-kDa pro-SCP-2’nin aktivitesi yoktur ve tamamen post-translasyonel olarak işlenmesiyle bir 2-kDa peptid ve bir matür 13-kDa SCP-2 oluşur (15). Günümüze kadar omurgalı SCP-2 genlerinin birçok özelliği ortaya çıkarılmış olup, SCP-2’nin inanlar, kurbağalar, zebra balıkları, köpekler, tavuk ve fareler arasında evrimesl olarak yüksek düzeyde korunmuş olduğu belirtilmektedir (36). Omurgalılarda SCP-2’nin sterol metabolizması ve steroid biyosentezinin önemli bir bileşeni olduğu gösterilmiştir (37,38). Ayrıca omurgalılarda SCP-2’nin kolesterol, doymuş asitler ve doymuş acyl CoA’a bağlandığı da tespit edilmiştir (37,39). Ayrıca SCP-2’nin mitokondride kolesterolün steroidlere döndürülmesini mitokondri içine girişi artırarak hızlandırdığı belirlenmiştir (40,41). Buna ilaveten SCP-2’nin mikrozom ve plazma membranı arasında sterol döngüsünü artırdığı (42), ve kolesterol veya steroid biyosentezine dahil olan dokularda yüksek düzeyde SCP-2 ekspresyonu olduğu ortaya çıkarılmıştır (37,43).

İnsketler kolesterol biyosentez yolağında önemli olan enzimlerden yoksundur ve bu sebeple kolesterolün hücre ve dokularda sentezi için uygun canlılar değildir (44). Bu faktör, insektlerin vücut yapıları ve büyüme hormanları gibi önemli biyobileşenler için zorunlu olan kolesterolün dış kaynaklardan sağlanmasını zorunlu kılmaktadır (45). Günümüze kadar Anopheles, Aedes ve Culex soylarındaki çeşitli sivrisinek türleri üzerinde SCP-2 genin metabolik yolakları ve çeşitli SCP-2 inhibitörü maddelerin sivrisinek gelişim parametreleri üzerine etkisi temelinde sivrisinek kontrolü için yenilikçi yaklaşımlarla araştırmaların yapıldığı görülmektedir (46). Ancak SCP-2 geninin farklı sivrisinek türlerinde moleküler yapısı ve gelişim dönemleri ile çeşitli vücut dokularındaki ifade düzeyleri üzerine araştırma açığı bulunduğu dikkati çekmiştir. Günümüze kadar Gen veritabanı incelendiğinde SCP-2 geninin çeşitli Anophel es türleri ile Cx, pipiens, Cx. quinquefasciatus ve Ae. albopictus türlerinin genom ve/veya transkriptom çalışmalarında anotasyonlandığı görülmektedir. Diğer yandan GenBank veritabanında direkt SCP-2 geni üzerine odaklanan Cx. quinquefasciatus, Ae. aegypti ve An. quadrimaculatus türleri için gen sekansları bulunmakta olup bunlardan yalnızca Ae. aegypti üzerine bir çalışmanın yayınlandığı görülmektedir (19). Mevcut bu veriler dikkate alındığında çeşitli sivrisinek türlerinde SCP-2 geninin açık okuma çerçevesinin yaklaşık 335 bp uzunlukta olduğu ve 110 aa uzunluğunda bir proteini kodladığı görülmektedir. Çalışmamızda Maculipennis grubun en önemli üyelerinden biri olan ve P. vivax için en etkin vektörlerden birisi olan An. sacharovi için SCP-2 geni ilk kez karakterize edilmiştir. Yukarıda bahsi geçen mevcut sivrisinek SCP-2 gen sekansları üzerinde yürüttüğümüz primer dizaynı çalışmalarında SCP-2 gen bölgesi ORF sekansını bütün olarak çoğaltan veya kapsayan bir fragmentin cDNA kalıbı içerisinde çoğaltılması mümkün olmamıştır. Ancak ilgili dizilimler içerisinde gerçekleştirilen analizlerde diğer Anopheles türleri ve diğer soylardan türlere ait gen sekansları arasında gerçekleştirilen analizlerle korunmuş bölgeler tespit edilmiş ve bu yönüyle de SCP-2 geninin değişken bölgeleri de içeren 216 bp fragmenti etkin olarak çoğaltılmıştır. SCP-2 gen bölgesi ORF sekansı çeşitli sivrisinek türlerinde 110 aa uzunluğunda ve 12.3 kDa büyüklüğünde bir proteni ifade etmekte olup çalışmamızda çoğalttığımız gen fragmenti bunun içerisinde 76 aa uzunluğunda ve yaklaşık 8 kDa büyüklüğünde bir proteini ifade ettiği in silico analizlerle gösterilmiştir. Sivrisineklerde SCP-2 ORF amino asit sekanslarının antijenite analizlerinde 5 antijenik bölge içerdiği, karakterize ettiğimiz An. sacharovi parsiyel amino asit sekansında diğer türlerin sekans bölgeleriyle de örtüşen 2 antijenik bölgenin bulunduğu görülmüştür. Ayrıca An. sacharovi SCP-2 amino asit sekansının ifade ettiği proteinin diğer sivrisinek türlerinde olduğu gibi transmembran bölge içermediği ve stoplazmik karakterde olduğu dikkati çekmiştir. Krebs ve Lan (19), karakterize ettikleri Ae. aegypti SCP-2 amino asit sekansının filogenetik analizinde, SCP-2’nin rat SCP-2’sine %30, memeli SCP-2’sinin sterol-transfer domainine %46 benzerlik gösterdiğini, ayrıca insan genomunda SCP-2-like geni (XM_115847.1) ile %50, An. gambiae (EAA08376) ile %79 ve üç Drosophila geni CG11151 (AE003493) ile de %25-38 benzerlik gösterdiğini belirtmişlerdir. Ayrıca araştırıcılar (19), SCP-2 gen sekansının Ae. aegypti nesilleri içerisinde yüksek düzeyde korunmuş olduğunu göstermişlerdir. Benzer olarak çalışmamızda sahadan izole edilmiş olan ergin dişi nesiller ve bunlardan elde edilen jenerasyonlardan alınan örnekleri içeren toplam 14 izolata ait SCP-2 nükleotid sekanslarının yüksek düzeyde korunmuş olduğu, yalnızca 2 izolatta 183. bazda tek nükleotid değişimi olduğu ancak bu değişiminde amino asit sekansında farklılığa yol açmadığı ve tüm ziolatların homolog amino asit dizilimi gösterdiği tespit edilmiştir. Ayrıca çalışmada karakterize edilmiş olan An. sacharovi SCP-2 nükleotid sekansları ile GenBank veritabanında mevcut sınırlı sayıda diğer sivrisinek türlerine ait SCP-2 sekanslarının filogenetik analizinde SCP-2 sekanslarının tür ve soy bazlı olarak izolatları monofiletik kümelere yerleştirdiği görülmüştür. Bu sonuç SCP-2 geninin sivrisinek türleri içerisinde korunmuş yapı sergilediğine dair destekleyici kanıt sağlamıştır. Bunun yanında SCP-2’nin Anopheles türleri arasında %10,45 oranında genetik farklılık gösterdiği, bu farklılığın Culex türleri ile yaklaşık %23,0 Aedes türleri ile ise yaklaşık %29’a yükseldiği dikkati çekmiştir. Ayrıca SCP-2 gen bölgesi filogenetik analiz sonuçları An. sacharovi’nin Anopheles türleri içerisinde An. stephensi’ye genetik olarak daha yakın olduğunu göstermiştir.

Bu çalışmada ekspresyon analizlerinde SCP-2’nin An. sacharovi’nin tüm gelişim dönemleri ve ergin dişilerin tükrük bezi, orta bağırsak ve yağ dokusunda farklı düzeylerde ifade olduğu gösterilmiştir. Omurgalıların aksine insekt hücreleri kolesterolü, lipoproteinlerin reseptör aracılı endositozu yoluyla orta bağırsak ve yağ doku arasında transfer edemez (47). Hidrofobik yapısı sebebiyle kolesterol, hazır olarak hücre membranının dış yüzeyi içine doğru dağılır ve SCP-2 gibi proteinler ilgili molekülleri membrandan ayrıştırır ve depolanacakları bölgeye ve metabolik yolaklarına teslim eder (48). Ae. aegypti SCP-2 proteini üzerine yapılan bir araştırmada (21), SCP-2’nin orta bağırsak epitelinde sitozol içinde lokalize olduğu ve overekspresyon sonucunda kolesterol seviyesinin yükseldiği gösterilmiştir. Buna ilaveten, Ae. aegypti SCP-2 ekspresyonunun larval beslenme döneminde orta bağırsakta yüksek seviyede olduğu gösterilmiş (19), ve SCP-2’nin kolesterolün dönüştürülmesi için orta bağırsakta pyhtosterollerin işlenmesine dahil olduğu belirtilmiştir (35). Nitekim araştırmamızda ergin dişi dokularında gerçekleştirdiğimiz ekspresyon analizlerinde Ae. aegypti’de araştırıcıların (19) elde ettikleri bulgulara paralel olarak orta bağırsakta SCP-2 ekspresyonu yüksek belirlenmiş ve tükrük bezine oranla yaklaşık üç kat daha yüksek düzeyde ifade olduğu belirlenmiştir. Diğer yandan çalışmamızda ergin dişi dokularından en yüksek ifade düzeyi yağ dokusunda (fat body) belirlenmiş, SCP-2’nin tükrük bezi ve orta bağırsaktaki ifade düzeyinden sırasıyla yaklaşık 15 ve 5 kat daha yüksek ifade olduğu görülmüştür. Bu sonuç ergin dişilerde SCP-2’nin yağ dokusunda kolesterol metabolizmasının regülasyonunda önemli bir fonksiyona sahip olabileceğine dair kanıtlar sağlamıştır. Diğer yandan Krebs ve Lan (19), Northern ve dot blotting analizleri ile gerçekleştirdikleri ekspresyon analizlerinde 4. dönem Ae. aegypti larvalarında orta bağırsağa göre fat body de içeren vücut duvarında SCP-2’nin ifade düzeyini oldukça düşük belirlemişlerdir. Bu sonuç da göz önüne alındığında sivrisineklerin gelişim dönemleri boyunca kolesterol metabolizmasının regülasyonunda bağırsak epiteli dışındaki organ ve dokularda da SCP-2’nin önemli bir fonksiyona sahip olabileceği hipotez edilebilir. Çalışmamızda ayrıca An. sacharovi’nin tüm gelişim dönemlerinde SCP-2’nin ekspresyon düzeyleri analiz edilmiş olup en yüksek ifade düzeyi ergin erkeklerde olduğu bunu sırasıyla ergin dişi, L4, L3, L2, L1 ve pupa dönemlerinin izlediği belirlenmiştir. Krebs ve Lan (19), Ae. aegypti üzerinde gerçekleştirdikleri SCP-2 ekspresyon analizlerinde metodoloji ve yöntem farklı olmakla birlikte çalışmamızda elde edilen sonuca paralel olarak 4. dönem larvadan pupaya geçiten sonra SCP-2 ifade düzeyinin oldukça düştüğünü belirtmişlerdir. Araştırıcılar (19), pupadan çıkan ilk gün dişi ve erkeklerde SCP-2’nin eşit düzeyde eksprese olduğunu ancak 7. günde yalnızca dişilerde saptanabilir düzeyde transkripsiyon gözlemlediklerini belirtmişler, protein düzeyinin ise her iki cinsiyet için de saptanabilir olduğunu kaydetmişlerdir. Çalışmamızda SCP-2 ekspresyonu gen düzeyinde spesifik qPCR analizleri ile gerçekleştirilmiş olup insektaryumda yetiştirilen ve %10 şekerli su ile beslemeleri sağlanan ergin erkeklerde dişilere oranla yaklaşık 3,5 kat daha yüksek ifade düzeyi saptanmıştır. Bu sonuç ergin erkek bireylerin kolesterol metabolizmasında SCP-2 aracılı regülasyonun çok daha yüksek olabileceğine dair kanıtlar ortaya çıkarmış olmakla birlikte bu hipotezin ilgili transkripsiyon ve protein sentez yolakları üzerine detaylı çalışmalarla aydınlatılması gerektiği düşünülmüştür.

SONUÇ

Bu çalışma ile vektör potansiyeli yüksek olan An. sacharovi için kolesterolün hidrofilik ortama taşınmasında ve metabolize olmasında en önemli proteinlerden birisi olan ve bu yönüyle de özellikle yeni biyoteknolojik ilaç yaklaşımları için önemli bir hedef olarak nitelenen SCP-2’yi eksprese eden gen bölgesi ilk kez karakterize edilmiş ve ilgili sivrisineğin gelişim evreleri ve dokularındaki ekspresyonel farklılıklar ortaya konulmuştur. Çalışma ile SCP-2’nin farklı sivrisinek türlerinde genetik yapısı ve çeşitliliği üzerine mevcut bilgi birikimine katkı sağlanmış ve özellikle Anopheles soyu içerisinde korunmuş yapısı ile SCP-2’nin bu soy içerisindeki türlere karşı geliştirilecek yenilikçi mücadele yaklaşımlarında hedef bir protein olarak kullanılabileceğine dair destekleyici kanıtlar sağlanmıştır.

*Etik

Etik Kurul Onayı: Sivrisinek materyali kullanıldığı için etik kurul onayı alınmamıştır.

Hasta Onayı: Sivrisinek materyali kullanıldığı için hasta onayı alınmamıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

* Yazarlık Katkıları

Konsept: S.A., Ö.D., A.Y., Dizayn: S.A., Ö.D., A.Y., Veri Toplama veya İşleme: S.A., Ö.D., A.Y., Analiz veya Yorumlama: S.A., Ö.D., A.Y., Literatür Arama: S.A., Yazan: S.A., Ö.D., A.Y.

Çıkar Çatışması: Yazarlar arasında bir çıkar çatışması bulunmamaktadır.

Finansal Destek: Çalışma Erciyes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TYL-2021-11456 no’lu proje ile desteklenmiştir.