GİRİŞ

Trichomoniasis, kamçılı bir protozoon olan Trichomonas vaginalis’in (T. vaginalis) neden olduğu, kadınlarda kötü kokulu akıntı, kaşıntı, ağrı ve üretrit ile karakterize, cinsel yolla bulaşan bir enfeksiyondur (1). Dünya Sağlık Örgütü’nün 2016 yılında yayımladığı raporda, T. vaginalis kaynaklı enfeksiyonların 156 milyon olduğu bildirilmiştir (2). Ülkemizde ise yapılan çalışmalarda T. vaginalis pozitifliği %3-9,4 arasında değişmektedir (3).

T. vaginalis, kadınlarda erken doğum ve pelvik enflamatuvar hastalıkları ile her iki cinste kısırlık gibi üreme sistemi sorunlarına neden olmaktadır (4,5). T. vaginalis enfeksiyonları kendi kendini sınırlamamakta ve genital epitelde nekroz ve kanamayla birlikte ülseratif olmayan enflamasyona neden olmakta ve bu durum, insan immün yetmezlik virüsü (HIV) geçişinin artmasıyla ilişkilendirilmektedir (6). Enfeksiyon, genellikle kötü kokulu sarı-yeşil akıntı, vajinal kaşıntı ve karın ağrısı gibi klinik belirtiler ile ilişkili olmakla birlikte bu belirtiler spesifik değildir.

T. vaginalis için en yaygın kullanılan laboratuvar tanı yöntemi direkt mikroskobik incelemedir (7). Armut biçimli trofozoitlerin dönme veya yuvarlanma biçimindeki hareketlerinin görülmesi ile kesin tanı konabilmektedir. Ancak, mikroskopi yönteminin duyarlılığının düşük olması (%38-82) nedeniyle negatif sonuçlar enfeksiyonu dışlamamaktadır (8). Direkt mikroskobik incelemeye ek olarak, Giemsa boyama (9), Modifiye Field boyama (10) ve sıvı bazlı Pap testleri (11) vajinal yaymalarda T. vaginalis tanısı için kullanılmaktadır.

T. vaginalis tanısında düşük maliyetli ve kısa sürede sonuç verebilen monoklonal antikorların kullanıldığı lateks aglütinasyon, immünofloresan, enzim bağlı immünosorbent (ELISA) ve immünokromatografi gibi serolojik yöntemler geliştirilmektedir (12,13). Nükleik asit amplifikasyon teknikleri, T. vaginalis’in saptanmasında kültür ve diğer tekniklerden daha duyarlıdır (14,15). Özellikle son dönemlerde yeni nesil dizileme tekniklerinin geliştirilmesi ile, T. vaginalis suşlarının genotip özellikleri de belirlenmektedir (16). Mevcut diğer tekniklerin aksine, moleküler teknikler ile düşük parazit yükü olan örneklere de tanı konabilmektedir (17). Moleküler yöntemlerin kullanılamadığı rutin laboratuvarlarda T. vaginalis varlığını saptamak için kültür yöntemi en doğru tercih olacaktır. Kültür yöntemi ile olguların %95’ine tanı konabilmekte ve kültür yöntemi ‘‘altın standart’’ olarak kabul edilmektedir (18). Bu çalışmada, rutin mikrobiyoloji laboratuvarında yaygın olarak bulunan besiyerlerinde T. vaginalis’in üretilmesi ve maliyet açısından en uygun besiyerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.

YÖNTEMLER

Parazit Suşu

Bu çalışmada kullanılan T. vaginalis suşu, Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazit Bankası’ndan temin edilmiştir.

Besiyerlerinin Tasarlanması

Rutin mikrobiyoloji laboratuvarlarında yaygın olarak bulunan tiyoglukolat besiyeri (THIO), brain heart infusion besiyeri (BHI), tryptic soya broth besiyeri (TSB) ve Brucella broth besiyeri (BRB) olmak üzere dört farklı sıvı besiyeri tercih edilmiştir. Her bir besiyerinin at serumu (ATS), fetal sığır serumu (FCS) ve insan serumu (İNS) ile zenginleştirilmiş üç formu hazırlanmış ve referans besiyeri olarak, at serumu ile zenginleştirilmiş TYM besiyeri kullanılmıştır.

Besiyerlerinin Hazırlanması

Denenen besiyerlerinden THIO, BHI, TSB ve BRB sırasıyla; 2,9, 3,7, 3,0 ve 2,8 g tartılarak 100 mL distile su içinde çözülmüştür. Referans besiyeri olan TYM ise; 0,5 mg L-cystein HCL, 0,1 g askorbik asit, 0,4 g K₂HPO₄, 0,4 g KH₂PO₄, 10 g trypticase, 2,5 g maltoz, 10 g yeast extract ve 0,25 g bacto-agar, 300 mL distile su içinde çözülerek hazırlanmış ve tüm besiyerleri 121 °C’de 15 dakika otoklavlanarak steril edilmiştir. Besiyerleri 45-50 °C’ye soğutularak steril cam tüplere 4'er mL dağıtılarak kullanılıncaya kadar +4 °C’de saklanmıştır. Besiyerlerine, kullanım öncesi antibiyotik karışımı (1 mg/mL streptomisin, 1,000 U/mL penisilin, 10 mg/mL gentamisin), at serumu (Gibco marka, steril ve inaktive, 26050088), fetal sığır serumu (Gibco marka, steril ve inaktive, A4766801) ve insan serumu eklenmiştir. İnsan serumu, rutin mikrobiyoloji laboratuvarına gönderilen, hepatit ve HIV açısından negatif olan, hasta serumlarından havuzlanarak toplanmış ve 56 °C’de 30 dakika bekletilerek inaktive edilmiş ve besiyerine eklenmeden önce 0,22 µm’lik bakteri filtresinden geçirilmiştir.

Parazit İnokülasyonu ve Üremelerin Değerlendirilmesi

Referans besiyerinde üretilmiş olan T. vaginalis trofozoitleri 10⁴ parazit/mL olacak şekilde hazırlanmış ve tüm besiyerlerine inoküle edilerek 37 °C’de 10 gün inkübe edilmiştir. Trofozoit sayısı hemasitometre, canlılık oranları ise tripan mavisi kullanılarak belirlenmiştir.

İstatistiksel Analiz

Grup sayısı üç ve üzerinde olduğundan grup ortalamasının karşılaştırılmasında Kruskal-Wallis H testi kullanılmıştır. Ayrıca veriler arasındaki ilişki Spearman’s korelasyonu ile değerlendirilmiştir. Anlamlılık değeri %5 kabul edilmiş ve veriler IBM SPSS 25.0 programı ile analiz edilmiştir.

BULGULAR

Denenen besiyerlerindeki T. vaginalis üremeleri, referans besiyeri olan TYM besiyeri ile kıyaslanmıştır. TYM-ATS besiyeri ile kıyaslandığında T. vaginalis üremelerinin, THIO-ATS’de çok daha iyi olduğu (p<0,05), THIO-FCS besiyerinin ise TYM-ATS besiyeri ile uyumlu olduğu görülmüştür (p>0,05). THIO-ATS ve THIO-FCS besiyerleri birbiri ile uyumlu bulunurken aralarında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır (p>0,05). THIO-İNS besiyerinde üreme görülmemiş ve 3. günde canlılık sona ermiştir. Parazit sayıları, THIO-ATS ve THIO-FCS besiyerlerinde sırasıyla, 5. ve 4. günde 100x10⁴ parazit/mL’ye ulaşmış ve bu günlerde canlılık oranları sırasıyla, %96,2 ve %88,9 olarak saptanmıştır. TYM-ATS besiyerindeki parazit sayısı 3. günde en yüksek seviyeye ulaşırken canlılık oranı %52,2 olarak tespit edilmiştir. THIO-ATS ve THIO-FCS besiyerlerinde canlılık sırasıyla 8. ve 7. güne kadar devam ederken; TYM-ATS besiyerinde 6. günde canlı parazit görülmemiştir (Tablo 1, Grafik 1a, b).

BHI besiyerlerinde, BHI-ATS ve BHI-FCS T. vaginalis üremesi açısından istatistiksel olarak birbiri ile uyumlu iken (p>0,05), BHI-İNS ile uyumlu bulunmamıştır (p<0,05). BHI-ATS, BHI-FCS ve BHI-İNS besiyerleri, TYM-ATS besiyeri ile kıyaslandığında, en iyi parazit üremesi BHI-ATS ve BHI-FCS besiyerlerinde görülmüş, BHI-İNS besiyerinde ise üreme görülmemiştir. BHI-ATS ve BHI-FCS besiyeri ile TYM-ATS besiyeri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yok iken (p>0,05), BHI-İNS arasında anlamlı bir fark bulunmuştur (p<0,05). Parazit sayıları, BHI-ATS besiyerinde 3. günde 100x10⁴ parazit/mL’ye, BHI-FCS besiyerinde ise 5. günde 98x10⁴ parazit/mL’ye ulaşmış ve bu günlerde canlılık oranları sırasıyla %96,2 ve %70 olarak saptanmıştır. BHI-ATS ve BHI-FCS besiyerlerindeki parazit canlılığı sırasıyla 7. ve 10. güne kadar devam ederken, TYM-ATS besiyerinde ise 6. günde canlı parazit görülmemiştir (Tablo 2, Grafik 2a, b).

TSB besiyerleri içinde, en iyi parazit üremesi yine at serumu ve fetal sığır serumu ile zenginleştirilmiş besiyerlerinde görülürken, insan serumu içeren besiyerinde üreme görülmemiş ve 3. günde canlılık sona ermiştir. TSB-ATS ve TSB-FCS besiyerleri parazit üremesi açısından TYM-ATS besiyerinden daha iyi olup her iki besiyeri ile TYM-ATS besiyeri arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir fark tespit edilmiştir (p<0,05). TSB-ATS ve TSB-FCS besiyerleri birbiri ile kıyaslandığında aralarında anlamlı bir fark gözlenmezken (p>0,05), bu besiyerleri ile TSB-İNS arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmuştur (p<0,05). Parazit sayısı, TSB-ATS besiyerinde 4. günde 100x10⁴ parazit/mL'ye, TSB-FCS besiyerinde ise 7. günde 82x10⁴ parazit/mL’ye ulaşmış ve bu günlerde canlılık oranı sırasıyla %66 ve %67,2 olarak saptanmıştır. TSB-ATS ve TSB-FCS besiyerlerindeki parazit canlılığı sırasıyla 9. ve 10. güne kadar devam ederken TYM-ATS besiyerinde ise 6. günde canlı parazit görülmemiştir (Tablo 3, Grafik 3a, b).

BRB besiyerlerinde T. vaginalis üremesi görülmemiştir. İnkübasyonun 2. gününde parazit sayısı ve canlılığının tüm BRB besiyerlerinde dramatik olarak azaldığı ve 3. günde canlılığın sonlandığı görülmüştür (Tablo 4, Grafik 4a, b).

TARTIŞMA

Trichomoniasisin belirti ve semptomları, diğer cinsel yolla bulaşan enfeksiyonların ve bakteriyel vajinozun neden olduğu belirtilere benzemektedir. Semptomatik olgularda, klinik belirtiler kötü kokulu akıntı, vaginal kaşıntı veya dizüri ile karakterize üretrit şeklinde kendini göstermektedir (19). Yapılan çalışmalar, enfekte kadınların yaklaşık %25’inin, erkeklerin ise %40-75’inin asemptomatik olduğunu göstermektedir (20,21). Trichomoniasisin klinik belirtileri spesifik değildir ve enfeksiyon sıklıkla asemptomatik seyretmektedir. Bu nedenle T. vaginalis enfeksiyonunun doğru tanısı için yüksek duyarlığa sahip, basit ve kolay ulaşılabilir laboratuvar testlerinin kullanılması gerekmektedir.

Rutin mikrobiyoloji laboratuvarlarında T. vaginalis tanısında en sık kullanılan yöntem, basit ve ucuz bir yöntem olan direkt mikroskopi; kolay uygulanabilir, düşük maliyetli ve kısa sürede sonuç verilebilmesine karşın, duyarlılığının düşük olduğu bildirilmektedir (18). Buna ek olarak, tecrübeli bir teknik eleman gerektirmesi ve hareketliliği azalmış düşük parazit yükü içeren örneklerde, trofozoitlerin lökositler ile karıştırılabilmesi yöntemin dezavantajlarını oluşturmaktadır. Direkt mikroskopinin bu dezavantajlarının tersine, T. vaginalis varlığını saptamak için “altın standart” olarak kabul edilen kültür yöntemi ile olguların %95’ine tanı konabilmektedir (7). Ticari olarak kullanıma sunulan sıvı besiyerlerinin dezavantajları arasında pahalı olmaları ve rutin mikrobiyoloji laboratuvarlarında kolayca bulunmamaları sıralanabilir (22). Çalışmamızda denenen besiyerlerinin karşılaştırmalı maliyet analizi yapıldığında, THIO, BHI ve TSB besiyerlerinin, TYM besiyerinden 3,5 kat daha düşük maliyetli olduğu tespit edilmiştir.

Bu çalışmada, sıklıkla rutin mikrobiyoloji laboratuvarlarında bulunabilen ve çeşitli bakterilerin üretilmesinde kullanılan zenginleştirilmiş besiyerlerinin modifiye edilerek T. vaginalis izolasyonunda kullanılması hedeflenmiştir. Poch ve ark. (23) THIO besiyerini modifiye ederek 176 hasta örneğini, Diamond besiyeri ve THIO besiyeri ile çalışmış ve THIO besiyerinin, T. vaginalis’in saptanmasında Diamond besiyeri kadar güvenilir olduğunu bildirmiştir. Ayrıca araştırmacılar, T. vaginalis kültürlerinde, vaginal kontaminasyonun en sık etkenlerinden olan Candida spp. türlerinin aynı amphoterisin B miktarı içermesine rağmen THIO besiyerinde daha az ürediğini rapor etmiştir (23). Adiloğlu ve ark. (24) tarafından yapılan farklı bir çalışmada ise, modifiye Diamond ve modifiye tiyoglikolat besiyerleri 269 hasta üzerinde çalışılmış ve toplam 34 olguda pozitiflik saptanmıştır. Duyarlılık, modifiye Diamond besiyerinde %94,1, modifiye tiyoglikolat besiyerinde ise %70,6 olarak bildirilmiştir (24). Benzer bir çalışmada, Kilimcioğlu ve ark. (25) klinik semptomu olan 300 hasta örneğinde T. vaginalis pozitifliğini Diamond, tiyoglukolat, TYM ve CPLM besiyerleri ile araştırmıştır. Yazarlar, Diamond ve TYM besiyerinde 24 saat sonra trofozoit sayısının 1,2x10⁴ parazit/mL yoğunluğa ulaştığını buna karşılık, tiyoglukolat ve CPLM besiyerlerinde trofozoit yoğunluğunun daha düşük olduğunu ancak Diamond ve TYM besiyerine kıyasla tiyoglukolat ve CPLM besiyerlerinde trofozoit canlılığının daha uzun sürdüğünü rapor etmiştir  (25). Bizim çalışmamızda THIO besiyerindeki canlılık süresi ve parazit sayısının TYM besiyerine kıyasla daha yüksek olduğu saptanmıştır.

BHI besiyeri, zor üreyen patojenik mikroorganizmaların izolasyonunda kullanılan zenginleştirilmiş bir besiyeri olup özellikle, Streptococcus pneumonia, Listeria monocytogenes ve Clostridium difficile’in üretilmesinde kullanılmaktadır (26,27). TSB ise yaygın olarak aerobik, fakültatif ve anaerobik bakteri ve mantarları da kapsayan çeşitli mikroorganizmaların gelişmesini destekleyici olarak kullanılan zengin bir besiyeridir. Aynı zamanda çeşitli bakterilerin antibiyotik duyarlılık testleri için de CLSI tarafından uygun görülmüştür (28). Literatürde BHI ve TSB besiyerlerinin T. vaginalis izolasyonu açısından araştırıldığı bir çalışmaya rastlanmamıştır.

Bu çalışma, T. vaginalis’in BHI ve TSB besiyerlerinde referans besiyerinden daha iyi üretilebildiğini gösteren ilk çalışmadır. T. vaginalis trofozoitlerinin, denenen BHI ve TSB besiyerlerinde  çok daha uzun süre canlı kaldığı saptanmıştır. Ayrıca fetal sığır serumu ile zenginleştirilmiş BHI ve TSB besiyerlerinin at serumu ile zenginleştirilmiş olanlar ile kıyaslanabilir performansa sahip olması, bu besiyerlerinin teminini kolaylaştırmaktadır. Ancak insan serumu ile zenginleştirilmiş besiyerlerinin hiçbirinde üreme saptanamamıştır.

Bu çalışmada ATS ve FCS ile zenginleştirilmiş THIO, BHI ve TSB besiyerlerinin altın standart kültür ortamı olarak kabul edilen TYM besiyerinden daha iyi sonuç verdiği gösterilmiştir. Buna karşılık BRB besiyeri ve insan serumu ile zenginleştirilmiş olan besiyerlerinin hiçbirinde T. vaginalis ürememiştir.

Çalışmanın Kısıtlılığı

Bu çalışmada tasarlanan besiyerlerinin performansı, logaritmik faza girmiş ve çoğalma potansiyeli yüksek olan bir T. vaginalis suşu ile denenmiştir. Besiyerlerinin etkinliğinin T. vaginalis’in klinik örnekten ilk izolasyonunda da denenmesi çok daha anlamlı olacaktır. Bir sonraki süreçte bu besiyerlerinin klinik örnekten T. vaginalis izolasyonunda denenmesi düşünülmektedir.

SONUÇ

Denenen THIO, TSB ve BHI besiyerlerinde T. vaginalis’in üreme potansiyelinin TYM besiyeri ile kıyaslanabilir olduğu görülmüştür. Ayrıca, bu besiyerlerinde T. vaginalis’in daha yavaş ürediği ve canlılığını uzun süre koruduğu tespit edilmiştir. Bu açıdan TYM besiyerinden daha avantajlı olan THIO, TSB ve BHI besiyerleri, rutin mikrobiyoloji laboratuvarında sıklıkla bulunabilmekte ve T. vaginalis’in kültür yönteminin uygulanabilir olmasına da imkan sağlayabileceği düşünülmektedir.

*Etik

Etik Kurul Onayı: Gerekli değildir.

Hasta Onayı: Gerekli değildir.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu tarafından değerlendirilmiştir.

* Yazarlık Katkıları

Konsept: Y.Ö., M.Ü., Dizayn: Y.Ö., Veri Toplama veya İşleme: Y.Ö., U.Y., G.Ü., A.Ö., M.Ü., Analiz veya Yorumlama: Y.Ö., U.Y., G.Ü., A.Ö., M.Ü., Literatür Arama: Y.Ö., U.Y., G.Ü., A.Ö., M.Ü., Yazan: Y.Ö.

Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Finansal Destek: Yazarlar tarafından finansal destek alınmadığı bildirilmiştir.