ÖZET
Amaç:
Çalışmamızda Nigella sativa’nın antihelmintik aktivitesi, bir model organizma olan Caenorhabditis elegans’lar (C. elegans) üzerinde test edilmiştir.
Yöntemler:
Çalışma için N2 (yaban tip) C. elegans ve Escherichia coli OP50, Minnesota Üniversitesi Ceanorhabditis Genetik Merkezi’nden satın alındı. C. elegans’lar NGM (Nematode Growth Medium) katı kültür ortamında büyütüldü. Senkronizasyonu yapılarak erişkin nematotlar %1, %0,1, %0,01, %0,001, %0,0001’lik konsantrasyonlarda Nigella sativa tohum yağına maruz bırakıldı. Çalışmada, 18 gün boyunca, deney ve kontrol grubundaki bütün nematotlar ölünceye kadar her gün canlı ve ölü nematotlar kaydedildi. Yutak pompalaması duran nematot ölü olarak kaydedildi.
Bulgular:
Çalışma bulgularımız incelendiğinde %1’lik konsantrasyonda petrilerdeki bütün nematotların dördüncü gün sonunda öldüğü görüldü. Buna ilaveten %0,1’lik konsantrasyonda beşinci gün sonunda hiç canlı nematoda rastlanmazken, %0,01’lik konsantrasyonda ise 13’üncü gün sonunda petrilerdeki bütün nematotların öldüğü tespit edildi. Veriler istatistiksel olarak incelendiğinde %0,1, %0,01, %0,001’lik konsantrasyon grupları ile kontrol grubu arasındaki fark anlamlıydı (p<0,05).
Sonuç:
Helmintlerin genellikle makroskobik boyutta olması ve birçoğunun kültürünün yapılarak laboratuvar ortamında üretilememesi bilimsel çalışmalar için büyük bir engeldir. Bu çalışmada, antihelmintik aktivite çalışmalarında C. elegans’ın iyi bir model olabileceği ve Nigella sativa’nın antihelmintik etkisi gösterilmiştir.
GİRİŞ
Helmintiasis, özellikle gelişmekte olan ülkelerde oldukça yaygın, birçoğu zoonoz, önemli paraziter hastalıklardandır. Helmint enfeksiyonları, gelişme çağlarında fiziksel büyüme ve entelektüel gelişim geriliğinin en önemli nedenlerinden biridir (1). Bununla birlikte, eğitim, ekonomik kayıp ve halk sağlığı önemine rağmen, tıp ve uluslararası sağlık kuruluşları tarafından büyük ölçüde ihmal edilmektedir (1). Yapılan çalışmalar helmint enfeksiyonlarının, infekte çocukların okul performansı ve ülke geleceğindeki etkilerinden söz etmektedir (2). Bunun yanı sıra entelektüel gelişim açısından bu enfeksiyonların biliş ve eğitim başarısı üzerine zararlı bir etkisi olabileceği de bildirilmiştir (2-4). Bunların sonucunda insanların antihelmintik ilaçlara yönelmesi direnç gelişiminin de sebeplerinden olmuştur (5,6).
Son yıllarda bitkisel kökenli ilaçların kullanımı her geçen gün artmaktadır. Birçok bitki çeşitli hastalıklarda tedavi aracı olarak kullanılmakta ve sentetik ilaçları aratmayacak etkiler görülmektedir. Özellikle ilacına direnç geliştiren patojenlerin eradikasyonunda bitkilerden elde edilen ürünler, geleneksel tedavi metodu olarak eski zamanlardan beri kullanılmaktadır. Tıbbi bitkilerin antihelmintik aktiviteleriyle ilgili çalışmalar oldukça azdır. Bunun sebeplerinden biri de helmintlerin birçoğunun laboratuvar ortamında kültürünün yapılamamasıdır. Bundan dolayı genellikle bu gibi çalışmalarda rat ya da fare gibi laboratuvar hayvanları, model olarak tercih edilmektedir. Ancak bilinmektedir ki hayvan çalışmaları, fazla iş gücü gerektirmesi, çalışma alanı sıkıntısı ve pahalı olması gibi birçok problemide beraberinde getirmektedir.
Caenorhabditis elegans (C. elegans), şubesi; Nematoda, sınıfı; Secernentea, takımı; Rhabditida, ailesi; Rhabditidae, cinsi; Caenorhabditis, türü; Caenorhabditis elegans olan, iplik kurdu olarak da adlandırılan bir nematotdur (Şekil 1). Erişkin bir kurtçuğun boyu bir milimetre civarındadır, bu nedenle incelemek için stereo mikroskop kullanılır. Büyüme ve üreme için nemli bir çevre, oda sıcaklığı, atmosferik oksijen ve besin olarak da bakteriye ihtiyaç duyar. Laboratuvar da bakım ve üretimi çok kolaydır. Erişkinleri bir mm boyunda olduğu için laboratuvarda çok az yer kaplar, rutin uygulamamalar için petri kapları ve bir mikroskop yeterlidir. Erkek ve hermafrodit olmak üzere iki cinstir. Hermafroditi sperm ve yumurta üretir ve kendi kendini döller. Erkek sadece sperm üretir ve döllemek için hermafrodite ihtiyaç duyar. Hermafroditin kendi kendine döllenmesi sonucu yine hermafrodit oluşurken, spontan olarak yaklaşık 1:1000 olasılıkla X kromozom ayrılamaması sonucu erkek oluşabilir. Erkek spermiyle döllenme sonucu ise erkek ve hermafrodit eşit oranda oluşur. Erişkin bir hermafrodit yaşamı boyunca yaklaşık 300 yumurta bırakabilir (7,8).
C.elegans’lardaki yutak ve omurgalılardaki kalbin ortolog olabileceğini düşündüren teoriler vardır. Bunlardan ilki hem omurgalı kalbi hem de C. elegans yutağı çift çekirdekli kas hücrelerine sahiptir ve lümenleri boyunca materyalleri taşırlar. Her iki organ da organizmanın yaşamının sürekliliği için devamlı pompalama yaparlar. İkincisi ise, her iki organında benzer uyarı ileti sistemi vardır. Kasılmalar bir gap junction ile senkronize edilir ve bunlar kas hücrelerine bitişiktir. Nöronal uyarı yokluğunda da kasılmalar devam edebilir (9,10). Bu sebeple yutak pompalamasını kaybetmiş C. elegans ölü olarak kabul edilir.
Çalışmamızda Nigella sativa (çörek otu)’nın antihelmintik aktivitesinin, bir model organizma olan C. elegans’lar üzerinde test edilmesi amaçlanmıştır.
YÖNTEMLER
Nigella sativa Tohum Yağı’nın Eldesi
Nigella sativa tohumları Sivas’ta satışa sunulan beş farklı satıcıdan eşit miktarda alındı, yıkanıp kurutulduktan sonra öğütüldü. Öğütülen tohumdan 100 gr tartılarak soxhlet cihazında petroleum ether (Sigma 77399) ile sekiz saat 40-60 °C’de ekstraksiyona tabi tutuldu (11). Elde edilen ekstrakt evaporatöre alınarak petroleum ether tamamen uçuruldu.
C. elegans Temini
Çalışma için N2 (yaban tip) C. elegans ve Escherichia coli OP50, Minnesota Üniversitesi Ceanorhabditis Genetik Merkezi (USA)’nden satın alındı.
C. elegans Kültür İşlemleri
Deneylerde katı kültür ortamı kullanıldı. Bu amaçla standart Nematode Growth Medium (NGM) olarak adlandırılan NGM agar ortamı hazırlandı.
Luria Broth Hazırlanması
BactoTryptone (5 g), Yeast Extract (2,5 g), NaCl (5 g), 1 M Tris (5 mL) tartılarak 500 mL deiyonize suda eritildi. 125°C’de 15 dakika otoklavlandıktan sonra soğutuldu.
Escherichia coli OP50 Suşunun Hazırlanması
Hazırlanan Lauria Broth içine Escherichia coli OP50 suşundan ekilerek 37 °C’de 24 saat bekletildi.
Nematot Growth Media (NCM) hazırlaması:
NaCl (3 g), Peptone (2,5 g), Agar (20 g) hassas terazide tartımları yapılarak 1 L deiyonize su içerisinde eritildi. 125 °C’de 15 dakika otoklavlandıktan sonra 55 °C’ye kadar soğutuldu. Daha önceden hazırlanan ve 0,2 µm gözenekli filtrelerden süzülen 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL kolesterol, 1 mL 1M MgSO4 ve 25 mL 1 M KPO4 (pH:6) besiyerine eklenerek homojenizasyonu sağlandı. Medium pH: 6’ya ayarlandı. Çalışma için içinde etken madde bulundurulan NGM’ler hazırlanana kadar 55 °C’de bekletildi.
C. elegans’ların üretilmesi ve pasajlanması için hazırlanan NGM’den, altı mm çapındaki petrilere 10 mL aktarılarak oda ısısında katılaşana kadar bekletildi. Üzerine üretilen E. coli OP50 suşundan 200 µL eklenerek kuruması beklendi. Petrilere C. elegans’lar pasajlanarak çoğaltıldı.
C. elegans’ ların Senkronizasyonu
Yaklaşık 10 adet erişkin C. elegans bakteri içeren NGM petri kutusuna aktarıldı. Altı saat süreyle yumurtlama olduktan sonra erişkin C. elegans’lar petri kabından çıkarıldı. Bu yumurtalar senkronize olmuş yavruları oluşturdu. Bunlar üçüncü günün sonunda erişkin forma gelince çalışmada kullanıldı.
Antihelmintik Aktivitenin Belirlenmesi
Steril ve 200 mL hacimli beher içine 1 mL Nigella sativa tohum yağından koyuldu. Üzerine 99 mL daha önceden hazırlanan ve 55 °C’de sıvı halde bekletilen NGM’den eklenerek homojenize edildi. Nematotların yaşam süresi boyunca çoğalmalarını engellemek amacıyla besiyerine FUDR (33 µL, 150 mM FUDR/100 mL NGM) katıldı. Elde edilen mediumdan 10’ar mL steril şartlar korunarak 6 mm çapındaki petrilere dağıtıldı ve oda ısısında katılaşmaları beklendi. Sonrasında üzerlerine E. coli OP50 suşundan 200 µL eklenerek kuruması beklendi.
Sonraki gruplar, %0,1, %0,01, %0,001, %0,0001’lik konsantrasyonlar şeklinde hazırlandı. Kontrol grubuna Nigella sativa tohum yağından eklenmedi.
Herbir konsantrasyondan 4 petri hazırlandı. Petrilere senkronizasyonu yapılmış ve erişkin C. eleganslar’dan 10’ar adet sterio mikroskop altında aktarıldı. Deney 18 gün sürdü ve deney gruplarındaki bütün nematotlar ölünceye kadar her gün canlı ve ölü nematotlar kaydedildi. Çalışma 22 °C’de 3 kez tekrarlandı. Çalışmamızda yutak pompalama hareketlerini kaybetmiş olan C. elegans’lar ölü olarak kaydedildi.
İstatiksel Analiz
Elde edilen verilerin istatistiksel analizleri için One Way Anova testinin yanı sıra tukey testi kullanıldı. Bu amaçla SPSS 16.0 (SPSS, Chicago, IL, Amerika) istatistik programı kullanıldı ve %95 güven aralığında p<0,05 değeri gruplar arası anlamlı kabul edildi.
BULGULAR
Çalışma bulgularımız incelendiğinde %1’lik konsantrasyonda petrilerdeki bütün nematotların dördüncü gün sonunda öldüğü görüldü. Buna ilaveten %0,1’lik konsantrasyonda beşinci gün sonunda hiç canlı nematoda rastlanmazken, %0,01’lik konsantrasyonda ise 13’üncü gün sonunda petrilerdeki bütün nematotların öldüğü tespit edildi (Şekil 2, Tablo 1). Veriler istatistiksel olarak incelendiğinde %0,1, %0,01, %0,001’lik konsantrasyon grupları ile kontrol grubu arasındaki farkın önemli olduğu görüldü (p<0,05). Gruplar arası veriler incelendiğinde ise %0,1’lik konsantrasyon ile %0,01’lik konsantrason arasındaki fark önemsizken (p>0,05) bu iki grubun diğer gruplar ile arasındaki fark önemli bulundu (p<0,05).
TARTIŞMA
Çalışmamızda erişkin C. elegans’lar üzerine Nigella sativa tohum yağında %1 ve %0,1’lik konsantrasyonlarda antihelmintik etki tespit edilmiştir. Çalışmamızda bu etkinin yanı sıra apatojen bir nematot olan C elegans’ların antihelmintik aktivitede bir model organizma olarak kullanılabileceği de gösterilmiştir.
Antihelmintik aktivite testlerinde C. elegans’ların model olarak kullanıldığı çalışmalar yeterli olmamakla birlikte literatürde mevcuttur. Yapılan bir çalışmada Ocimum sanctum uçucu yağının C. elegans’lar üzerinde antihelmintik etkileri NGM ortamında test edilmiş ve bitkinin güçlü bir antihelmintik etki gösterdiği sonucuna varılmıştır (12). Sudan’da yapılan bir çalışmada 14 bitki türünün su ekstraktlarının antihelmintik aktiviteleri araştırılmış ve model olarak C. elegans’lar kullanılmıştır. Balanites aegyptiaca ve Sesbania sesban türleri çalışmaya alınan bitkiler arasında en güçlü antihelmintik etkiye sahip bitkiler olarak gösterilmiştir (13). Kanada’da yapılan çalışmada 26000 adet kimyasal maddenin antihelmintik etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla patojen nematotların temsilcisi olarak C. elegans’lar kullanılmıştır. Çalışma sonucunda 14 yeni antihelmintik etkili kimyasal literatüre kazandırılmıştır (14). Bizim çalışmamızda da C. elegans’lar, gerek laboratuvar ortamında kolay üretilmesi, yer kaplamaması, çok fazla iş gücü gerektirmemesi gerekse apatojen olmasından dolayı enfeksiyon riskinin bulunmamasından ötürü güvenli çalışma ortamı sağlamasıdan dolayı model organizma olarak tercih edilmiştir.
Nigella sativa’nın nematotlara, tenyalara, kancalı kurtlara karşı esansiyel yağları üzerine yapılan antelmintik çalışmalar sonucu, nematotlara ve tenyalara karşı oldukça etkili bir aktivite gösterdiği gösterilmiştir (15). Yapılan bir çalışma sestot enfeksiyonu olan çocukların Nigella sativa tohumları ile tedavi edilebildiği bilgisi verilmiştir. Çalışmada Nigella sativa tohumları satın alınıp kurutularak toz haline getirilmiştir. Nematot ve sestot enfeksiyonundan muzdarip altı çocuk kontrol grubu olarak tedavi edilmezken deney grubu orak gruplanan çocuklar 20, 30 ve 40 mg/kg dozunda Nigella sativa oral yolla uygulanmış ve 3, 7 ve 15’inci günlerde 1 gr dışkı örneğindeki parazit yumurtaları kontrol grubuyla karşılaştırılmıştır. Çalışma sonucunda Nigella sativa’nın sestot enfeksiyonunu önemli bir şekilde azalttığı görülmüştür (16). Yine Nigella sativa tohumlarının antihelmintik amaçlı geleneksel tıpta kullanıldığına dair araştırmalar literatürde mevcuttur (17). Başka bir çalışmada Hymenolepis nana ile doğal olarak enfekte 28 isviçre albino faresi 3 gruba ayrılmıştır. Birinci grup kontrol grubu olarak tedavi edilmezken diğer iki gruba 2,5 mL/kg ve 5 mL/kg dozlarında Nigella sativa tohum yağı oral yolla verilmiştir. Gruplar incelendiğinde, 5 mL/kg dozunda Nigella sativa tohum yağı verilen grubun 14 gün sonunda tam olarak iyileştiği, bunun yanı sıra diğer grubun 21 gün sonra tam olarak iyileştiği bildirilmiştir (18). Yapılan başka bir çalışmada Trichinella spiralis ile enfekte ratlarda Nigella sativa’nın proflaktik ve terapötik etkisi araştırılmıştır. Çalışmada enfeksiyondan sonra 7’inci ve 20’inci günlerde bağırsakta yetişkin solucan sayısı, enfeksiyondan sonraki 60. günde kaslarda larva sayımı, parazitin üreme kapasitesi test edilmiş, Trichinella spiralis larvalarına karşı antikorların oluşumu ELISA ile araştırılmıştır. Çalışma sonucunda iki hafta boyunca 5 mL/kg dozda oral yolla uygulanan Nigella sativa tedavisinin Trichinella spiralis’e karşı güçlü bir proflaktik ve terapötik etkisinin bulunduğunu bildirmişlerdir (19).
Nigella sativa’nın kimyasal bileşimi hakkında yapılan çalışmalar, bitki ekstraktının birçok organik bileşiği içerdiğini göstermektedir. Tohum ekstraktının bir GC-MS analizi, bunun sekiz yağ asidi ve 32 uçucu terpenin bir karışımı olduğunu göstermiştir. Analiz sonucu thymoquinone (30%-48%), thymohydroquinone, dithymoquinone, p-cymene (7%-15%), carvacrol (6%-12%), 4-terpineol (2%-7%), t-anethol (1%-4%), sesquiterpene longifolene (1%-8%) oranlarında tanımlanmıştır ve Nigella sativa’nın tıbbi etkilerinin bu bileşiklerden kaynaklandığı düşünülmektedir (20-22).
Bizim çalışmamızda da Nigella sativa tohumlarının literatüre uyumlu bir şekilde antihelmintik aktivite gösterdiği tespit edilmiştir. Bu veriler özellikle ilacına direnç geliştiren türlerin tedavisi açısından oldukça önemlidir. Bunun yanı sıra çalışma bulgularımızın literatürdeki in vivo çalışmalarla uyumlu olması, C elegans’ların bu gibi çalışmalarda model olarak kullanılmasının güvenilirliğini de göstermektedir.
SONUÇ
Yapılan antihelmintik çalışmaların birçoğu laboratuvar hayvanlarının parazitle enfekte edilmesiyle gerçekleştirilmektedir. Laboratuvar hayvanlarıyla yapılan çalışmalar gerek iş gücü gerekse çalışma alanı açısından oldukça güçtür. Helmintlerin genellikle makroskobik boyutta olması ve birçoğunun kültürünün yapılarak laboratuvar ortamında üretilememesi bilimsel çalışmalar için büyük bir engeldir. Bu çalışmada antihelmintik aktivite çalışmalarında C. elegans’ın iyi bir model olabileceği ve Nigella sativa’nın antihelmintik etkisi gösterilmiştir.
* Etik
