ÖZET

Amaç:

Türkiye’de, Kutanöz leishmaniasis (KL) tedavisinde meglumin antimonat (Glucantime^®) ve sodyum stiboglukonat (Pentostam^®) kullanılmaktadır. Ancak son yıllarda bu ilaçlara direnç oluştuğu bildirilmektedir. Bu çalışmada; dirençli Leishmania suşlarının Amfoterisin B, Miltefosin, Meglumin Antimonat, Paromomisin ve Sodyum Stiboglukonat etkenlerine karşı duyarlılığının in vitro olarak araştırılması amaçlanmıştır.

Yöntemler:

Meglumin Antimonat tedavisi iki kür uygulanan, ancak klinik iyileşme gözlenmeyen hastalardan elde edilen ve Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Parazit Bankası’nda saklanan 5 Leishmania izolatı seçilmiştir. Seçilen izolatlar ITS1 bölgesine özgü primer ve problar kullanılarak gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu analizi ile tiplendirilmiştir. Her izolatın; Amfoterisin B, Miltefosin, Meglumin Antimonat, Paromomisin ve Sodyum Stiboglukonat etken maddelerine karşı, 500, 250, 125, 50, 25 μg/mL konsantrasyonlarında, ilaç direnç düzeyleri XTT ve hemositometre yöntemiyle çalışılmıştır.

Bulgular:

Ülkemizde KL etkeni olan ve iki kez meglumin antimonat tedavisine rağmen klinik ve paraziter iyileşme göstermeyen hasta lezyonlarından elde edilen dirençli Leishmania tropica izolatlarının Amfoterisin B’ye hiç direnç göstermedikleri ve sırası ile Miltefosin, Sodyum Stiboglukonat, Paromomisin ve Meglumin Antimonat’a karşı duyarlı oldukları gözlenmiştir. Kontrol grubu Leishmania tropica (MHOM/AZ/1974/SAF-K27) izolatının ise beş etken maddenin ilaç konsantrasyonlarının hiçbirinde canlılığını sürdüremediği görülmüştür.

Sonuç:

Seçilen dirençli L. tropica izolatlarının hiç birinin Amfoterisin B’ye direnç gösteremediği çalışmada saptanmış ve istatiksel olarak da ortaya konulmuştur (p<0,05). Elde edilen verilerin, ilaç çalışmaları yapan ve yeni ilaç molekülleri araştıran klinisyen ve araştırıcılara yol göstermesi açısından önemli olduğu sonucuna varılmıştır.

GİRİŞ

Ülkemizde Urfa çıbanı, Antep çıbanı, Şark çıbanı, güzellik yarası gibi çeşitli isimler ile bilinen kutanöz leishmaniasis (KL), günümüzde hala önemini koruyan bir paraziter hastalıktır (1,2). Dünya Sağlık Örgütü verilerine göre her yıl 1,5 milyon yeni KL olgusunun olduğu ve önemli bir kısmının Afganistan, Cezayir, Suudi Arabistan ve Suriye gibi ülkelerde görüldüğü bildirilmiştir (3).

Türkiye’de 1990-2010 yılları arasında toplam 46,003, 2011-2017 yılları arasında ise toplam 21,370 KL olgusu olduğu Sağlık Bakanlığı tarafından bildirilmiştir (1,4). Ülkemizde Güney Doğu Anadolu Bölgesi başta olmak üzere günümüzde tüm bölgelerde KL olguları görülmeye başlanmıştır (5).

KL lezyonları, kişinin immünite durumuna bağlı olarak bazı olgularda kalıcı skar bırakarak kendiliğinden iyileşebilmektedir. Ancak hastaların hem estetik kaygılarının önlenmesi hem de enfeksiyon kaynağı olmalarından dolayı bütün hastaların tedavi edilmesi önerilmektedir (1,6). KL tedavisinde, ilk seçenek olarak beş değerli antimon bileşikleri [meglumin antimonat (Glucantime^®) ve sodium stibogluconate (Pentostam^®)] tercih edilmektedir. Beş değerli antimon bileşiklerinin kontrendikasyon olduğu zamanlarda ise amfoterisin, miltefosin, pentamidin gibi çeşitli alternatif ilaçlardan faydalanılmaktadır (6,7).

Ülkemizde KL tedavisinde, 1940’lı yıllarda klinik etkinliği tanımlanan beş değerli antimon (SbV) bileşikleri ilk seçenek olarak kullanılmaktadır. Meglumin antimonat (Glucantime^®) ve sodyum stiboglukonat (Pentostam^®) bu grup içerinde yer almaktadır. KL tedavisinde yaklaşık %90 bir etkinliği olduğu bildirilmiştir. Leishmania amastigotları üzerinde glikolitik enzimleri, yağ asidi oksidasyonunu, DNA ve RNA sentezini inhibe ederek etki etmektedirler. Ancak bu grup ilaçlar ağır metaldir ve son yıllarda dirençli suşların ortaya çıkmasına bağlı olarak alternatif ilaçlara gereksinin duyulmaya başlanmıştır (8,9).

Beş değerli antimon bileşiğinde yer alan ilaçlar ile tedaviye yanıt alınamayan hastalarda miltefosinin kullanılabileceği yapılan araştırmalarda bildirilmiştir. Ancak miltefosinin pahalı bir ilaç olmasının yanı sıra organizmadaki yarılanma ömrünün uzun olması, hastalarda şiddetli bulantı benzeri yan etkilerinin olması ve ülkemizde miltefosin preparatının bulunmaması gibi birçok dezavantajı bulunmaktadır (6,8).

Tedaviye cevap alınmayan KL olguların tedavisinde antifungal bir ilaç olan amfoterisin B’den de yararlanılmaktadır. Yapılan araştırmalarda, KL tedavisinde klinik olarak direncin rastlanmadığı tek ilacın amfoterisin B olduğu bildirilmiştir (6). Ancak miltefosin gibi maliyeti yüksek bir ilaçtır ve hastanın tedavi süresince gözleminin yapılması gerekmektedir (7).

Paromomisin, 1960’lı yıllarda anti-leishmanial etkisi bildirilen, genel olarak bakteriyel enfeksiyonlarda kullanılan aminoglikozid grubu bir antibiyotiktir (10). %12 metilbenzetanyum içeren %15’lik paromomisin kombinasyonlarının özellikle L. major enfeksiyonlarında etkili olduğu ancak yan etkilerinin de bulunduğu yapılan araştırmalarda bildirilmektedir (9).

KL tedavisinde ülkemizde, meglumin antimonat (Glucantime^®) ve sodyum stiboglukonat (Pentostam^®) ilaçları kullanılmaktadır. Son yıllarda bu ilaçlara karşı direnç olduğu bildirilmektedir. Dirençli bu olguların tedavisinde hangi ilaçların hangi dozlarda etkili olduğunun araştırılarak klinisyenlerin bu konuda bilgilendirilmesi hastaların tedavileri açısından büyük önem kazanmaktadır. Çalışmamızda amfoterisin B, miltefosin, meglumin antimonat, paromomisin ve sodyum stiboglukonatlara karşı duyarlılığının Leishmania tropica izolatlarında in vitro olarak araştırılması amaçlanmıştır.

YÖNTEMLER

Toplam 10 doz intralezyoner olarak 2 kez meglumin antimonat (Glucantime^®) tedavisi almış ancak hem klinik olarak hem de parazitolojik olarak iyileşme gözlenmeyen toplam 5 KL hastasının lezyonundan NNN besiyerine ekimi yapılarak elde edilmiş ve kriyoprezervasyonu yapılarak sıvı azot tankında saklanmakta olan izolatlar kullanılmıştır (Tablo 1).

Sıvı azot tankında bulunan beş izolat uygun koşullarda sıvı azot tankından çıkarılarak çözdürülmüş ve NNN besiyerlerine ekilmeleri yapılmıştır. NNN besiyerleri 25 ^oC’de inkübasyona bırakılmış ve izolatların üreme durumu günaşırı kontrol edilmiştir. NNN besiyerinde üreyen promastigotlar içerisinde RPMI 1640 (RPMI 1640+ %10 fetal bovine serum) besiyeri bulanan flakslere aktarılmış ve tekrar inkübasyona bırakılmıştır. Flaksler günaşırı üreme yoğunluğu açısından kontrol edilmiştir. Flakslerdeki üreme yoğunluğu 10⁷ promastigot/mL olunca genotiplendirilmesi ve in vitro ilaç direnç çalışmaları yapılmıştır.

İzolatların genotiplendirilmesi leishmania ITS-1 gen bölgesine özgü primer ve problar kullanılarak gerçek zaman-polimeraz zincir reaksiyonu (GZ-PRZ) yöntemi ile yapılmıştır (5,11,12). Bu çalışma, T.C. Manisa Celal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi Sağlık Bilimleri Yerel Etik Kurulu’nun 07/12/2016 tarih ve 20.478.486-399 sayılı kararı ile alınan etik kurul onayı ile gerçekleştirilmiştir.

İn vitro İlaç Direnç Testleri

Çalışmada, 96’lık düztabanlı hücre kültürü plağının kuyucukları 3’ü blank (kör kuyucuk), 3’ü ilaçsız parazit kontrol, 3’ü meglumin antimonat (Glucantime^®, Fransa) ve 3’ü sodyum stiboglukonat (Pentostam^®, İngiltere) olacak şekilde gruplara ayrılmış ve her kuyucuğa 100 µL RPMI 1640 besiyerinden (%10 FCS +%1 penisilin/streptomisin +%1 gentamisin) ilave edilmiştir. Direnç testi uygulanacak olan meglumin antimonat ve sodyum stiboglukonat olarak işaretlenen bölmelerin her birinin ilk kuyucuğuna her bir ilaçtan 100 µL kendi bölmelerine eklenmiştir. İlk kuyucuktan 100 µL alınarak seri sulandırması 500, 250, 125, 50 ve 25 µg/mL olacak şekilde aktarılmış ve blank bölmeleri hariç tüm kuyucuklara 100 µL promastigot süspansiyonundan (10⁶ promastigot/mL) konulmuştur. Doksan altılık düz tabanlı hücre kültürü plağının etrafı parafinle kaplanarak 48 saat süre ile 25 ^oC’de inkübasyona bırakılmıştır. Daha sonra hemositometre yöntemi ve XTT direnç testi ile in vitro direnç düzeyleri saptanmıştır.

Hemositometre Yöntemi

Etüvdeki plaklar çıkarılmış ve Neubauer’in Thoma lamı yardımı ile leishmania promastigotları sayısı belirlenmiştir. Her bir kuyucuktan ayrı ayrı örnek alınarak 40X’lik büyütmede sayım yapılmıştır. Bu amaçla Thoma lamının köşelerinde bulunan toplam dört kare ve orta kısımda bulunan kare içerisindeki promastigotlar sayılmıştır. Sayılan toplam promastigot sayısı 10,000 ile çarpılmış ve elde edilen rakam sayılan kare sayısına bölünerek mL’deki promastigot sayısı tespit edilmiştir.

XTT (Sodium 3,39-[1-(phenyl amino carbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) Benzene Sülfonik Asit Hidrat) Direnç Testi

XTT direnç testi çalışması için, etüvden yeni bir 96’lık düztabanlı hücre kültür plağı çıkarılmıştır. Plağın her bir kolonunda bulunan kuyucuklardaki solüsyondan 100 µL alınmış ve yeni bir hücre kültür plağına aktarılmıştır.

Kit içerisinde bulunan regent solüsyonundan 5 mL, electron coupling solüsyonundan ise 0,1 mL alınarak karıştırılmıştır. Yeni hücre kültür plağının her bir kuyucuğuna hazırlanan bu karışımdan 50 µL ilave edilmiş ve 25 ^oC’lik etüve konularak 4 saat süre ile inkübe edilmiştir. Süre sonunda spektrofotometrede 450 nm’de absorbans değeri ölçülerek canlılık hesaplaması yapılmıştır. Yapılan deneyler üç defa tekrar edilmiştir (5) (Şekil 1-2).

Elde edilen verilerin, Sidak’s multiple comparisons testi uygulanarak istatiksel analizi yapılarak değerlendirilmiştir.

BULGULAR

İzolatların GZ-PRZ yöntemi ile genotiplendirilmesi sonucu beş izolatında L. tropica ile uyumlu pik verdiği gözlenmiştir.

Dirençli KL olgularına ait Leishmania tropica izolatlarının in vitro duyarlılık çalışmalarında 500 µg/mL ilaç konsantrasyonunda beş etken madde arasında anlamlı bir fark görülmemiştir. Tüm ilaçlar parazitleri öldürmüştür (p>0,05). İn vitro testlerde 250 µg/mL ilaç konsantrasyonunda ise amfoterisin B tüm ilaçlardan daha etkili bulunurken daha sonra sırası ile miltefosine, sodyum stiboglukonat, paromomycin ve meglumin antimonatın kontrol grubuna göre etkili olduğu görülmüştür (p<0,05). Kontrol grubu ile karşılaştırdığımızda 125 µg/mL ve 50 µg/mL ilaç konsantrasyonlarında amfoterisin B, miltefosin ve sodyum stiboglukonatın etkili olduğu (p<0,05), paromomycin ve meglumin antimonatın etkisiz olduğu (p>0,05), 25 µg/mL ilaç konsantrasyonunda amfoterisin B (p<0,05) nin etkili olduğu diğer tüm ilaçların etkisiz olduğu ve amfoterisin B dışında aralarında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadığı görülmüştür (p>0,05). Kontrol grubu (referans izolat) L. tropica (MHOM/AZ/1974/SAF-K27) izolatının ise beş etken maddenin ilaç konsantrasyonlarının hiçbirinde canlılığını sürdüremediği görülmüştür.

Ülkemizde KL etkeni olan ve iki kez glukantime tedavisine rağmen klinik ve paraziter iyileşme göstermeyen hasta lezyonlarından elde edilen dirençli Leishmania tropica izolatlarında parazitlerin amfoterisin B’ye hiç direnç göstermedikleri ve sırası ile miltefosine, sodyum stiboglukonat, paromomycin ve meglumin antimonata karşı duyarlı oldukları görülmüştür (Şekil 3).

İstatistiksel Analiz

Elde edilen verilerin, Sidak’s multiple comparisons testi uygulanarak istatiksel analizi yapılarak değerlendirilmiştir.

TARTIŞMA

KL lezyonlarının birçoğu kendiliğinden iyileşebilmekte ancak tedavi edilmediğinde kalıcı iz bırakabilmektedir. KL lezyonlarının kendiliğinden iyileşme süresi L. tropica ile L. infantum’da 6-20 ay ve L. major’da ise 2-6 ay arasında değişmektedir ancak bu süre kişiden kişiye farklılık göstermektedir. Hastaların KL için kaynak olabileceğinden tanı konulan tüm hastaların tedavi edilmesi gerekmektedir (1,6,13).

KL tedavisinde beş değerli antimon bileşikleri kullanılmaktadır. Ancak son yıllarda KL’nin endemik olduğu birçok ülkede, tedaviden alınan sonuçlardaki başarısızlıkların artmakta olduğu bildirilmektedir (14). KL’de bu grup ilaçlara direnç gelişmekte olduğu ve bu nedenle tedaviye yanıt alınmayan KL olgularında miltefosin, amfoterisin B, paromomisin gibi çeşitli alternatif ilaçlar kullanılmaktadır (1,6).

İntravenöz olarak uygulanan amfoterisin B’nin böbrekler üzerinde ciddi yan etkileri bulunmaktadır (15,16). Oral olarak kullanılan miltefosin, pahalı bir preparat olmasının yanı sıra teratojen etki gösterebilmektedir (16). Topikal yolla uygulanan Paromomisin ise nadirde olsa renal ve sekizinci kranial sinir toksisitelerine neden olmaktadır. Bunun yanı sıra topikal sağaltımla birlikte beş değerli antimon bileşiklerinin birlikte kullanılması sonucu %90 başarı elde edildiği bildirilmiştir (17,18).

Ateş ve ark. (8) ülkemizde KL tedavisinde kullanılan beş değerli antimon bileşikleri ile sonuç alınamadığı zamanlar miltefosin preparatının tercih edilmesinin tedavideki başarı oranını artıracağı görüşünde olduklarını bildirmişlerdir. García Bustos ve ark. (19) 2014’de, deney farelerinin ayak tabanlarında oluşturdukları leishmania enfeksiyonunda meglumin antimonat ile miltefosini karşılaştırarak incelemişler ve miltefosinin etkili ve güvenli bir alternatif tedavi seçeneği olduğunu belirtmişlerdir. Ayrıca miltefosinin, meglumin antimonat’dan daha etkili bir preparat olduğu da vurgulamışlardır.

Yeşilova ve ark. (7) intralezyonal ve sistemik meglumin antimonat tedavisine bağlı lokal yan etki gelişmiş bir KL olgusunu sistemik amfoterisin B ile tedavi etmişler ve özellikle beş değerli antimon bileşiklerine dirençli olgularda amfoterisin B’nin, tedavide alternatif bir ilaç olarak kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Mushtaq ve ark. (20) ise haftada bir intralezyonel amfoterisin B (2,5 mg / mL) enjeksiyonu uyguladıkları beş KL tanılı hastanın hepsinin tedaviye iyi yanıt verdiğini ve intralezyonel amfoterisin B’nin Eski Dünya KL suşları üzerinde güvenli ve etkili bir tedavi sunduğu sonucuna varmışlardır. Ancak ilaç etkinlik değerlerini belirlemek için kontrol çalışmalarının yapılması gerektiğini de vurgulamışlardır. Hollanda’da 2017 yılında KL tanılı 2 askerde günde 3 kez 28 gün boyunca oral olarak miltefosin (50 mg) tedavi protokolü uygulamışlardır. Her iki hastanın da miltefosine yanıtının iyi olduğunu ve ilacın yan etkilerinin ise az olduğunu belirtmişlerdir (21).

Hamzavi ve ark. (22) İran’ın Fars eyaletinde, vücudunda birden fazla sayıda KL lezyonu bulunan sekiz yaşındaki bir kız çocuğuna meglumin antimonat ve amfoterisin B ile uygulanan birçok tedaviden sonuç alınamadığını ancak miltefosin ve amfoterisin B’nin birlikte kullanımı sonucunda başarılı bir şekilde hastayı tedavi ettiklerini bildirmişlerdir.

Etkeni L. major olan KL lezyonların tedavisinde, topikal Paromomisinin kullanımı ile tedavide başarılı sonuçlar alındığı bildirilmektedir (23). El-on ve ark. (24) 1986 yılında yaptıkları bir çalışmada L. major’un etkeni olduğu 67 KL olgusunun tedavisinde Paromomisin kullanmışlar ve hastaların %87’sinin tedavisinde başarılı sonuç almışlardır. Mussi ve ark. (9) %10 Paromomisin içeren hidrofilik merhemi deneysel olarak enfekte Balb/c fareler üzerinde değerlendirmişler ve KL’nin topikal tedavisinde alternatif bir seçenek olabileceğini belirtmişlerdir. Chacko ve ark. (25) Kanada Toronto’da üç buçuk yaşındaki KL pozitif bir erkek hastanın tedavisinde topikal olarak Paromomisin kullanmışlardır. Yaklaşık üç aylık bir sürede çok iyi bir sonuç aldıklarını ve bir yıl sonra yapılan kontrolde nüks olmadığını bildirmişlerdir.

KL’nin endemik olarak görüldüğü ülkelerden biri olan İran’da, KL tedavisinde beş değerli antimon bileşikleri ilk tedavi seçeneği olarak kullanılmaktadır ancak son yıllarda ülkede bu ilaçlara karşı direnç geliştiği bildirilmiştir. Bu dirençli izolatların aynı zamanda pentostam ile amfoterisin B’ye de dirençli olduğu ancak miltefosine ile Paromomisine ise duyarlı olduğu gösterilmiş ve İran’da leishmaniasis tedavisinde miltefosin ve paromomisinin kullanılmasının yararlı olabileceğini saptamışlardır (26).

Çalışmamızda dirençli KL izolatlarının öncelikle GZ-PZR analizi ile tür tayini yapılmış ve iki kez tedavi olmuş ancak tekrarlayan lezyonları bulunan beş KL olgusundan izole edilmiş L. tropica suşların amfoterisin B, miltefosine, meglumin antimonat, paromomycin ve sodyum stiboglukonatlara karşı duyarlılığının in vitro araştırılması yapılmıştır.

Bizim de bu çalışmadan elde ettiğimiz sonuçlarda, ülkemizde KL etkeni olan ve iki kez meglumin antimonat (Glucantime^®) tedavisine rağmen klinik ve paraziter iyileşme göstermeyen, hasta lezyonlarından elde edilen dirençli L. tropica izolatlarında parazitlerin amfoterisin B’ye direnç göstermedikleri daha sonra ise sırası ile miltefosine, sodyum stiboglukonat, paromomycin ve meglumin antimonata karşı duyarlı oldukları görülmüştür.

SONUÇ

Türkiye’de son yıllarda görülen iklim değişikliğine bağlı olarak sıcaklığın artması bu parazitin Türkiye’de var olan vektörlerinin sayısının artmasına sebep olmuştur. Ayrıca son yıllarda ülkemize gelen mültecilerin sayısının artması ve gelen mültecilerin de endemik bölgelerden gelmesi bu sayının artmasına katkı sağlamıştır. Bu gibi sebeplerden dolayı ülkemizdeki parazitlerin vektörlerinin dağılımlarının artmasına bağlı olarak hastalık yaygınlaşmakta ve leishmaniasise karşı direnç gelişmektedir. Bu çalışma ile dirençli olguların tedavisinde alternatif olabilecek ilaçların belirlenmesi, kullanılan ilaçların dozlarının tedavi edilebilirlik açısından incelenmesi sonucunda elde edilecek bu verilerin klinisyenlerle paylaşılarak klinisyenler açısından yol gösterici olması ve hastaların tedavilerinin sorunsuz çözümlenmesi açısından önemli olduğu sonucuna varılmıştır.

* Etik